Blog der Abistokratin

Kleine DNA-Stücke werden anhand dieser Methode unbegrenzt vermehrt. Sie nutzt das Prinzip der Replikation.

Komponenten:

• Die Original-DNA, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält
• Zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird.
• DNA-Polymerase, die bei hohen Temperaturen nicht zerstört wird, um den festgelegten Abschnitt zu kopieren (z. B. Taq-Polymerase)
• Die Basen-Bausteine (Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin) für den von der DNA-Polymerase synthetisierten DNA-Strang

Vorgang:

• Isolierte doppelsträngige DNA, die den zu untersuchenden Abschnitt enthält, wird in einem Reaktionsgefäß erhitzt.
• Denaturierung der DNA: Es kommt zur Spaltung in die beiden Einzelstränge.
• DNA-Hybridisierung: Zwei synthetisierte DNA-Primer lagern sich bei niedriger Temperatur an die Einzelstränge an. Die Basensequenzen der Primer sind komplementär zur DNA-Sequenz, die den zu vermehrenden Bereich begrenzt. 
• Durch die Hybridisierung entstehen zwei kurze doppelsträngige DNA-Abschnitte, die als Starter für die DNA-Polymerase dienen.
• Bei der DNA-Polymerase handelt es sich um ein hitzestabiles Enzym aus dem Bakterium Thermus aquaticus. Es muss daher nach dem Erhitzen nicht ersetzt werden.
• Die Taq-Polymerase katalysiert bei ca. 72°C die 5’ à 3’-DNA-Synthese an den Einzelsträngen. Dazu verwendet die Polymerase, die sich ebenfalls im Reaktionsgefäß befindenden vier Nukleotid-Sorten (Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin).
• Nach etwa 4min wird die Replikation durch 2minütige Temperaturerhöhung auf 94°C abgebrochen. Die Doppelhelixstränge werden so wieder zu Einzelsträngen denaturiert
• Danach wird die Temperatur wieder erniedrigt (55°C, 3min), was zur erneuten Anlagerung der Primer führt.
• Bei einer Erhöhung auf 72°C wird die Taq-Polymerase wieder aktiv und vermehrt erneut den Zielbereich der DNA.

à Zyklus:

Þ    Denaturierung

Þ    Primerbindung

Þ    DNA-Synthese durch Polymerase

…

à läuft meist 30-60mal ab. Nach 30 Zyklen ist die Zielsequenz auf das 250-Millionenfache vervielfältigt.

Ziel:

Þ    Schnelle Vermehrung winziger DNA-Mengen.

Þ    Anhand einer einzigen Zelle kann z.B. eine Virusinfektion, ein genetischer Defekt oder Krebs, sowie Verwandtschaftsverhältnisse festgestellt werden.

Þ    Beim „genetischen Fingerabdruck“ wird nur Junk-DNA benutzt, die keine Erbinformationen enthält, aber trotzdem individuell ist.  

Anwendungsgebiete:

o       Genetischer Fingerabdruck

o       Vaterschaftstest

o       Erkennung von Krankheiten

o       Klonierung von Genen

o       Analyse alter (fossiler) DNA

o       Geschlechtsbestimmung (z.B. bei Tieren)

o       Mutagenese (Funktionsuntersuchung der DNA oder von Proteinen)